河北11选5

天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司为您免费提供超高压提取食用菌灭菌设备超高压实验设备等相关信息发布和最新资讯,敬请关注!

全国热线电话:

13332066993
联系我们CONTACT US
  • 售前电话:13332066993
  • 售前QQ:1435150553
  • 售后电话:13502049060
  • 售后QQ:3404628094
  • 邮箱:1435150553@qq.com
  • 网址:www.djoscure.com
  • 厂址:天津西青区津静公路海泰发展一道3号
新闻详情NEWS ARTICLE

食用菌灭菌设备 压力诱导折叠中间体对蛋白质DNA识别和病毒装配至关重要

来源:/news/94.html发布时间:2017-07-10

对于各种基本的生物过程,食用菌灭菌设备蛋白质-核酸的相互作用是非常重要的,例如复制、转录、限制、翻译和病毒的装配。蛋白质-DNA和蛋白质-RNA识别的分子基础深深地涉及到系统的热动力学。我们用近似相同的方法,静水压做为重要的工具,利用几种分光技术,特别是荧光循环二色和高分辨率核磁共振,在这里回顾蛋白质-核酸如何相互作用,蛋白质-核酸相互作用涉及蛋白质折叠和蛋白质装配。高压有唯一的部分蛋白质折叠状态或熔球状态稳定特性。正确折叠和错误折叠之间的竞争,这导致很多蛋白质不可溶聚合的形成,在生物技术工业和人类疾病中是一个很重要的问题,例如淀粉样变性病、Alzheimer、prion和瘤病。压力研究揭示了部分折叠(熔球)结构变化率,出现在几种细菌、植物和哺乳动物病毒的伸展和完全折叠的结构之间。利用压力,我们发现核蛋白中间体,那里壳蛋白部分伸展,几乎跃入RNA。这些中间体是抗病毒化合物的潜在目标。关于病毒的压力研究,直接应用到生物工艺学。压力灭活病毒的能力已有评价,发展疫苗和灭活病毒具有前景。最近的研究证明,压力灭活病毒保留了免疫特性。有一个实质的证据,在’熔化中间状态’高压循环诱使病毒丧失传染性保留了免疫原性。保留了所有的正面的特性。
   1.前言 
    这里将回忆,在水溶液中的蛋白质增加适量的蛋白酶,已经是化学亚稳定系统,以致水解成氨基酸成分。
    蛋白质-核酸混合物在细胞中发挥重要的功能,特殊混合体的形成被还没有完全清楚的规则支配[1,2].。蛋白质-核酸相互作用的难以捉摸的特性来自于其成分的大量的相互作用,包括相对较弱的能量(低于10 kcal/mol)。这些相互作用高能的耦合很可能基于识别过程的高特殊性。选择核酸顺序的机制在数百万竞争顺序中与蛋白质相结合,向自由蛋白质自然地折叠推移,形成固有功能的形式的机理。最终,需要分离和描述折叠、低聚物和与核酸相互作用时发生的中间体结构。这里,回顾几种情况,这些中间体是在压力下得到的,其动力学和结构是用荧光、光散射、NMR和水力的方法测得的。
    Weber在他的著作中指出[3],在常温带有压力的反应中标准自由能的变化是简单的,他们将调查在常压下温度影响的任何考虑。压力在形态趋势上,影响变性或解离和原始形式之间的平衡,占据一个很小的体积[4^8]。蛋白质结构区域对压力最敏感的是疏水核心,特别是出现空腔时[9]。它被描述如下,压力对分离的熔球的唯一的特性或在部分折叠状态(‘部分’熔球)促成蛋白质片断的出现。压力对蛋白质和蛋白质-核酸混合物的影响有生物工艺学的应用。用压力灭活病毒被证明在疫苗发展和杀灭病毒方面是有用的[10^14]。图1举例,将核糖体中多肽的可能的构象路径系统地表达出来。它跟随折叠路径导致形成功能合成体,一个结合DNA或装配到高分子结构的蛋白质,例如病毒。换而言之,蛋白质脱离路径,引起错误折叠结构,通常形成聚合。高压能将这些每一个反应都探究出来,它将在下面讨论。
    图1 蛋白质和多分子合成体的折叠和装配示意图。(1)伸展蛋白质;(2)折叠中间体;(3)第三级结构;(4)蛋白质错误折叠-聚合;(5)蛋白质-DNA相互作用;(6)病毒
    2.体积容腔模型
    氨基酸残余物被翻译成直线顺序三维结构的机制,在生物学中是主要挑战之一。虽然大部分热动力学研究用常规的干扰中间体,例如高温、尿素、胍等,它们提供有限的信息,特别是因为在蛋白质结构中发生剧烈的变化,不可能出现生理学条件。因为溶剂排斥空腔和被约束的溶剂的释放,所以蛋白质的折叠或一个蛋白质与另一个蛋白质装配伴随着体积的增加。无极性氨基酸残余物插入,盐键形成时水被释放[5^8]。在以往情况下,疏水作用有极为重要的作用。
    埋入蛋白质或内部蛋白质相互作用,Gibbs自由能(和平衡常数)依赖反应的标准体积的变化(ΔV):
    式中:ΔGp和ΔGo分别是是在压力p作用下和在一个大气压下的缔合/折叠的自由能;K是一个大气压下分裂或变性的平衡常的潜在的机理数;ΔV是体积的变化;Kp是在压力p下的反应的程度;C是蛋白质浓缩,n是分裂亚元的数目。在稳定蛋白质方面,不同成分的包装起着重要的作用。因为与大量的原子相关,包装的缺陷不可避免,这导致空穴的形成[15]。蛋白质的不可压缩性显示在球状蛋白质的原子包装的密度被限制,共价键的角度和距离的恒定提高到10kbar [4,5]。Earlier的研究显示了蛋白质内部结构的空穴和可压缩性的各向异性的分配[16,17]。空穴也与一些蛋白质和高分子装配的亚稳性有关[18^21]。最近的研究表明对探讨包装和空穴,静水压是一个有用的工具[9,19^21]。Royer和他的同事获得了有力的证据[9],他们设想蛋白质结构内在的空穴提供了大量的观察到的体积的变化。实验和理论都接近表明压力伸展的潜在的机理是水穿透并进入了蛋白质的基质[22,23]。
    3. 在压力下蛋白质折叠中间体,熔球和淀粉基因结构分裂
    大家普遍公认,揭示蛋白质折叠对分离和描述中间体结构是必须的。一些中间体在压力下被捕捉到,并且仔细观察了它们的动力学和结构特性。几种典型的蛋白质被用来研究蛋白质折叠的中间体,包括Arc repressor[22,24^26]、溶解酵素[27]、从人类刺瘤病毒得到的E2 DNA-粘合域(E2-DBD) [28,29]、核糖核酸酶A[30]、胰岛素[31]、脱辅基红蛋白[32]、RalGDS的Ras粘合域[33]和二个氢原子的叶酸还原酶[34]。在压力下,Arc repressor衰减器的可逆的分裂进入部分折叠亚元[24],并且利用二维1H核磁共振(NMR[25,26])部分地确定了压力变性单体的结构。部分折叠的压力变性的蛋白质结构限制了大量的水[22],在水被有机溶剂取代时,压力变性不会进行。较后的结论被理论研究法所证实,水渗透到蛋白质[23,35]。用osmolytes保护葡萄球菌核酸酶[36]、F0F1-ATPase [37]和人体干扰素-Q重组细胞不被压力变性[38]。
    少数单倍体蛋白质是研究蛋白质折叠的最好的模型,但是它们通常对标准设备可以达到的压力过于稳定。最近我们使用了稳定性较低的共价混合物,它是从胰凝乳蛋白酶抑制剂-2的补充片断得到的,用于研究蛋白质折叠的平衡和动力学。合成体的压力变性完全独立于蛋白质的浓缩,标明变性的异性二聚物的形成。在原肌球蛋白盘绕-再盘绕二聚物的情况下,压力导致了变性二聚物的形成。在磷酸丙糖异构酶情况下,对于压力分裂曲线的浓缩依赖性的缺乏是由于亚元成分不同。CI-2混合物的压力变性结构特性能用熔球结构来解释,类似得到的E2-DBD和Arc repressor。在压力下,进一步的动力学研究确认了带有残留的稳定的结构的变性的CI-2结合体。
    3.1 错误折叠的中间体
    最近蛋白质折叠在医学界和生物技术界引起了极大的兴趣。折叠中间体的分离对理解错误折叠和蛋白质聚合是至关重要的。去年,几种疾病,例如Alzheimer's病、帕金森病、海绵状脑病(由prions引起)、遗传肺气肿、囊肿性纤维化和很多癌症,都是由蛋白质错误折叠造成的[43,44]。生物技术团队也面临着很多问题,它们在不同的细胞内表达时,包括在体内的蛋白质的聚合。图1显示了功能蛋白质和高分子装配可以从折叠途径转移的错误折叠和聚合的死胡同。最近证明,在硫氰酸酶[45]、在抗菌素P22 [46]尾部的蛋白质、肌球素[47]、淀粉体蛋白质transthyretin [48]中,压力允许用来探索两个路径(聚合/错误折叠和正确折叠)。在P22 [46]尾部的聚合中,高压引起了分裂并导致单体和天然折叠三分子聚合物的形成[46]。
    压力还用于盐酸胍低浓缩中大的蛋白质聚合物的分离[49]。随着在医学和生物技术的应用,这些研究开辟了用于高压聚合的新方法。
    关于淀粉基因transthyretin的结果[48],更近的关于抑制瘤的p53蛋白质,提出能通过小心地调整高压和温度获得稳定的中间体。Transthyretin (TTR)是四聚物人体血浆蛋白质,它负责家族淀粉样多神经病(FAP)和老年全身淀粉样疾病(SSA) [50]。在其他特性中,部分折叠TTR是由压力凝固bis-ANS引起的,类似酸-变性蛋白质,经受聚合进入淀粉纤维[48]。解压后形成稳定性较低的四聚物TTR(一个解开亚元的‘预先聚合状态’),在低温时保持样品能防止聚合[48]。中间体的分离提供了一个空前的目标,为了发展闭塞蛋白质错误折叠和聚合的对象的能力,对抗淀粉基因和瘤的潜在的药物。
    压力还用于盐酸胍低浓缩中大的蛋白质聚合物的分离[49]。随着在医学和生物技术的应用,这些研究开辟了用于高压聚合的新方法。
    关于淀粉基因transthyretin的结果[48],更近的关于抑制瘤的p53蛋白质,提出能通过小心地调整高压和温度获得稳定的中间体。Transthyretin (TTR)是四聚物人体血浆蛋白质,它负责家族淀粉样多神经病(FAP)和老年全身淀粉样疾病(SSA) [50]。在其他特性中,部分折叠TTR是由压力凝固bis-ANS引起的,类似酸-变性蛋白质,经受聚合进入淀粉纤维[48]。解压后形成稳定性较低的四聚物TTR(一个解开亚元的‘预先聚合状态’),在低温时保持样品能防止聚合[48]。中间体的分离提供了一个空前的目标,为了发展闭塞蛋白质错误折叠和聚合的对象的能力,对抗淀粉基因和瘤的潜在的药物。
    最近我们调查了由于瘤抑制蛋白质p53的DNA-粘合范围的压力引起的错误折叠的结构。大部分人类癌症(≈50%)由p53蛋白质转变而成,主要在其DNA-粘合范围(p53/DBD),影响DNA粘合能力和/或蛋白质的稳定性[51]。我们的结果证明,在静水压37℃时,p53/DBD经受变性,导致错误折叠和聚合状态。然而,我们调查4℃时压力的影响,蛋白质变性被置换到高压,聚合没有随变性发生(未公开的结论)。这些研究显示压力探测中间体和确定它们的结构是有用的,它对药物的合理设计是有价值的。
    4.蛋白质-DNA相互作用
    基因是蛋白质粘合到特殊DNA顺序的开关[1,2]。为了关键生物学功能,例如翻录、翻译、复制、基因调整、病毒装配和再结合,蛋白质-核酸的相互作用组成了框架。来自X-射线结晶学和NMR的结构数据证明, 通过Van der Waals与静电和氢键结合得到DNA顺序的阅读[1,2,52,53]。
    结构研究不能脱离每一个因素的作用。蛋白质亚元的协同相互作用在预定的特殊DNA地址中扮演重要的角色[52^54]。按照扮演者(不同的范围、DNA、粘合的蛋白质)解释相互作用,除了结构之外还需要生物物理的研究。共价的相互反应能用高静水压进行可逆的干扰,它允许蛋白质折叠,蛋白质-蛋白质和蛋白质-配合基表现为热动力学的相互反应。关于渗透性和静水压和蛋白质-DNA联合体的特殊性的研究有非常高的价值[55,56]。
    Sligar团队得到的结果显示,在DNA特殊识别时,水溶剂起到很重要的作用。静水压的应用,抵消了渗透压的影响 通过恢复酶的水合的外壳,恢复正确的识别的模式[55]。
    在最初关于讨论对蛋白质-核酸相互作用的研究中,Royer等发现四聚物紫胶抑制剂,一种螺旋-翻转-螺旋DNA-粘合蛋白质,被诱发剂稳定,被DNA失去平衡,表明了亚元相互反应之间有重要的粘合,操作者粘合并诱发出亲和力。在几种情况下,特殊蛋白质-DNA联合体的形成伴随着无极性的相互反应和溶剂的释放,这说明了溶剂没有置换成非特定的联合体时,特别粘合物的熵-驱动特性[58,59]。另一方面,真核状态的转录因子因素似乎对水合作用的影响和协同反应并不敏感,在粘合特殊DNA地址时,蛋白质占优势的作用。
    4.1.蛋白质-DNA相互作用中水的作用
    高压的应用有几个超过其它方法的优势,因为它影响蛋白质结构,而不影响它的DNA[60]。用Arc抑制基因系统,核酸-蛋白质识别过程是与蛋白质折叠和低聚化相联系的[61]。原有的二聚物的稳定性是由特殊的蛋白质-DNA相互反应决定的[58]。在Arc蛋白质(P8L)的突变异种中,自由能的链接缺失,用相等的低的亲和力连接操作基因和非特定DNA顺序。DNA粘接和部分折叠单体向原有二聚物的变换之间的连接,似乎承认了操作基因DNA的能力。通过蛋白质抑制基因-操作基因联合体,在零下温度和压力下的冷变性,我们看到熵的明显的增加,Arc操作基因紧紧地粘合在其操作基因的顺序上,但是在松弛地粘接在非特定的顺序上时,不是这样。熵的增加能使蛋白质识别特殊和非特殊DNA的顺序。我们假定蛋白质-操作基因联合体的形成伴随着非极性反应的增加和溶剂的释放,它解释了熵-驱动特性,然而在非特定联合体中溶剂并没有被置换[58]。换而言之,蛋白质-DNA的反应是“干”的,然而,非特定反应是“湿”的。这一假设由图2展示出来,它延伸了蛋白质-核酸反应在病毒中的概念。
    Fig. 2. Schematic representation of Arc^DNA recognition (A) and a T = 3 RNA virus assembly (B)
    总之,Hippel [2]对静水压和渗透压的研究定位了几个问题,试图解释蛋白质怎样识别DNA唯一的顺序和基因组中数百万竞争的非特定的地址。Hippel指出,理解蛋白质-DNA的识别,包括:(1)定义核酸表面的疏水内容;(2)评估水合作用和结构的差异,它识别非特定和特定蛋白质-核酸联合体。压力的研究部分地回答了这些问题。
    由于无极性反应是升温的和可压缩的,它们对压力和低温很敏感。受压的和冷的生物联合体能做为研究水合作用和结构的有用的热动力学的工具。Hippel对这些问题提供一般的答案,如图2 所示,特定的蛋白质-核酸联合体(在蛋白质-DNA联合体和病毒颗粒)比蛋白质-蛋白质相互反应对低温更敏感,它稳定折叠蛋白质。
    这个结果证明,在特定反应形成中脱水的至关重要的作用。特别是Arc-DNA相互反应,显示出特定的蛋白质-蛋白质DNA联合体比非特定联合体更多的脱水。
    4.2 特定DNA在固定中的作用
    在LexA抑制基因中的蛋白质-蛋白质的相互作用和人类刺瘤16 LexA 抑制基因的E2 DNA-粘合范围(E2c)蛋白质是202-残基蛋白质,在17基因周围与蛋白质修补DNA相关的编码中,它管制SOS系统的埃希氏大肠杆菌中的复制[62]。LexA有两个域[62],它在两个域之间柔性铰链的84-85残基中经受自动分裂。通过高消散核磁共振确定了DNA粘合域的溶液的结构[63]。随着LexA抑制基因,我们发现蛋白质是二聚物在nanomolar浓缩方面,并发现分裂常数依赖picomolar的范围。
    然而,非特定DNA没有稳定性影响,特定DNA引起二聚物的紧密和Kd 中750-折叠的增加(图3)。因此,LexA二聚物通过RecA-诱导自动蛋白质水解,只丧失识别特定DNA顺序的能力[64]。我们的发现表明,在生理学条件下,LexA和二聚物一样存在于细胞内部。Walker [65]指出,根据最近LexA突变异种的晶体结构内, LexA二聚物的结构与RecA/ssDNA反应是至关重要的[66]。
图3 DNA粘合对LexA二聚物的影响
    LexA准备(2 WM)用下列34-基对低(聚)核苷酸培育:(i) recA操作基因;(ii) recA半操作基因;(iii) poly GC (E),被(GC)10束取代的全部SOS单元,用表示的没有DNA控制。
图4 在高压下通过E2 DNA-粘合域(E2c)达到平衡的图示
    从晶体结构测量椭圆体二聚物(E2)2纵向直径有46 A [21],每个单体约为23 A。高压下单体部分地变性为状态A,它部分地保留了第三级结构,出现更紧凑的分离的单体。
    从刺瘤病毒得到的蛋白质E2是病毒DNA复制和转录的控制者[67]。刺瘤病毒蛋白质E2是一个C-端处理域(E2n),用柔性铰链,从C-端DNA粘合以及二聚域(E2c) 分离而成的。这个从高危险人类刺瘤病毒(HPV-16)得到的二聚域,能被压力解离成单节显性状态,它穿过一个高度可逆变换,提供了一个实在的残留结构[28]。这个高压状态的进一步的伸展能通过尿素的低浓缩来实现。NMR研究证实E2c被压力解离的单体是高折叠的[29]。图4显示了二聚物E2转换成紧凑的、折叠的单体。
    E2c-DNA联合体(带着特定的和非特定的顺序)的分裂不能单独地使用压力获得[29]。考虑压力和尿素的关于E2c稳定性的研究,提供了等价的热力学参数,我们得到了特定和非特定DNA的不同的浓缩尿素的等压线。无论是E2c联合体,还是E2c的二聚物,ΔGo与压力相对的图表都是线性的[29]。在图5中,来自压力/尿素研究的压力分裂数据表明,当比作蛋白质时,特定的和非特定的DNA顺序大大促进了E2c二聚物的稳定性。已经观察到,特定DNA顺序自由能(ΔΔGo =6.7 kcal/mol)比非特定DNA顺序自由能(ΔΔGo =4.5 kcal/mol)的变化要大。由特定和非特定的DNA之间发生的影响不同或许是基于顺序的识别。
    在体积没有变化时DNA改变高压变性曲线(图5A),表明E2c在DNA分裂时没有额外的表面积出现。结果表明E2c二聚物分裂成单体一直限制了DNA(图5 B)。通过荧光[28]和NMR [29]的数据,确证了E2c的功能单节显性单元的假设,用分离的单体保留了大量的三级结构。这一研究开辟了发展以单体为目标的药物新的方法,它奠定了防止和治疗刺瘤的传染性的可能。
图5 (A)在DNA存在时E2c分裂的等压线
    二聚物250 nM E2c在压力下交联程度的变化,显示出二聚物在非特定DNA和特定DNA250 nM存在时的稳定性[29]。
    (B)E2c粘合DNA的单体—二聚物平衡的图表。蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互反应的体积的变化符合阴影的标记。
5.病毒的装配
    病毒粒子促使它们的基因组在免疫力低下主体和主体的细胞之间移动。病毒粒子由有包膜或无包膜蛋白质外壳和核酸组成[68]。蛋白质外壳按照路径沿用复官能:核酸的防护、化学反应粒子成熟的分享和刺入细胞的能力和分解。外壳蛋白质通常安排到二十面外壳中。包裹有传染性的基因组中,必须形成外壳时60亚元的整倍数,导致了亚元之间不衡等的接触[68]。
    压力从事于如何使对病毒粒子成功地装配需要的可塑性编码,进入衣壳蛋白质亚元原有的结构[59]。这个热动力学和结构方法相结合试图确定控制病毒装配的一般规则。总之,衣壳蛋白质(单体或二聚物)比装配的20面粒子对压力的稳定性更低[59]。在装配路径中,单独的衣壳和装配的中间体呈现不同的部分折叠状态[12,69^72]。在二十面体病毒疏水核的单氨基酸亚元中抵抗压力和化学变性的稳定性大幅降低。高压允许我们捕捉核蛋白中间体(抗病毒药物的潜在目标),那里衣壳蛋白部分伸展,但限制了RNA. [12,69^72]。中间状态出现在空衣壳的分裂中,例如P22 procapsids [71,73]。
    蛋白质和蛋白质-核酸相互作用对病毒装配的贡献已经在细菌、植物和动物病毒中测定[12,14,69^74]。在典型的实例中,豇豆花叶病毒(CPMV),通过比较空衣壳和核蛋白粒子压力稳定性的比较,自由能的链接被评估。空衣壳比核蛋白粒子的稳定性更低[69]。
    5.1. Free-energy stabilization in the ion of icosahedral shells(二十面体外壳形成中自由能的稳定性) 
    烟草花叶病毒(TMV)压力引起的分裂,螺旋结构,最初是由Lauffer和Dow[75]报告的,最近由Bonafe [76]等报告,同样地完成了在压力下冷变性研究。压力研究显示完整病毒颗粒和它的衣壳蛋白的稳定性是不同的。P22抗菌素的单节显性的衣壳蛋白对压力很敏感,并且在2kbar[70]以下的压力下发生变性,然而在压力达到2.5 kbar时T=7 衣壳没有分裂。仅在高压和低温条件下,P22衣壳蛋白即可分裂,表明它们的熵是稳定的[70].。因为T=7 dsDNA病毒的装配需要骨架蛋白,分裂是不可避免的。
    几种单一的氨基酸代替突变异种被利用分割抗菌素P22[73,77]的二十面体网格的自由能的稳定性的因素。W48Q突变异种壳在室温下很容易被压力分裂。
    5.2.二十面体病毒装配时核蛋白联合体的分离和蛋白质折叠的速率
    几种病毒在压力分裂时发现了核蛋白中间体[12,69^72],如所见的小核糖核酸病毒的情况(图6) 我们假设压力降低时核蛋白中间体作为核准备再生粒子。核蛋白中间体的一个不寻常的特征是出现部分伸展的衣壳蛋白粘合RNA。衣壳装配时,RNA显然扮演了陪护的角色。RNA缺位时,亚元趋向紊乱的结构,而且紊乱是孤独的时候不能复性。核蛋白中间体是抗病毒药物的潜在的目的。
图6 小核糖核酸病毒通过尿素变性的高浓缩(A)或高压和低温(B)分解的模型
    A 高浓缩尿素用从衣壳蛋白分离RNA的方法得到的完全分裂和变性(尿素伸展亚元被伸长为乱绕线圈型)
    B 相反,提高压力降低温度,使二十面体结构分裂,但是衣壳蛋白(VP1, VP2 and VP3)一直保持与RNA的连接,在恢复到大气压和室温时,该粒子丧失了传染性。传染性的丧失是因为VP4被释放和‘据为己有的因子’。
    核蛋白中间体似乎有一个浓缩结构[72],并且证明外壳蛋白-RNA联合体具有高可塑性。在不同病毒的压力研究中发现的另一个共同的特点是在装配衣壳和核蛋白中间体(RNA病毒的情况下)、解离自由单元(二聚物或单体)和最后伸展单体时,减少了折叠的结构。在衣壳和伸展单体中的完全结构的衣壳蛋白之间,我们提出熔球状态的斜度[58,68^72]。高压最初将影响衣壳蛋白的导致部分伸展的四级和三级结构、熔球结构。与之相比,高尿素浓缩最初将破坏二级结构。 
    5.3. Structural transition in insect and mammalian viruses induced by pressure(通过压力诱使昆虫和哺乳动物病毒结构的转变)
    Viruses are macromolecular assemblies designed to exert their biological role in a single sequential cycle:
    (1) assembly inside the cells; 
    (2) release to the environment;
    (3) attachment to new host cells; 
    (4) disassembly and delivery of genome; 
    (5) replication of the genome and transcription of new viral proteins.
    在单顺序循环中,病毒是高分子装配是按照设计发挥生物学的作用:
    (1)在细胞内装配;
    (2)释放到外界;
    (3)放到新的宿主细胞;
    (4)基因组的拆卸和装配;
    (5)基因组的复制和新病毒蛋白质的转录
    按照这5个步骤,衣壳的解体和核酸的拆卸是最少理解的[68]。细胞吞噬后,在准确的时间最快地、有效地发生解体。这一过程的开关通常归因于在细胞吞噬囊内的酸性的pH,但是在vitro中,在低pH附近,是没有无衣壳的,或无衣壳慢慢发生,与快速复制的需要是不相容的。高压为探讨动物病毒的无衣壳提供了一个有力的工具。
    小核糖核酸病毒族,包括几种重大经济和医学意义的几种病毒[78]。这些病毒有六十个由四种不同蛋白质VP1 至 VP4的拷贝组成的共同的衣壳结构,它们的三维结构有相似的一般特征[78]。Oliveira等[12]描述了这些病毒的抵抗压力和冷变性的稳定性的差异。脊髓灰质炎病毒和]鼻病毒对室温下的高压是稳定的,压力达2.4kbar不足以促进病毒解体和灭活。
    在相同的压力范围内,口足病病毒(FMDV)粒子明显地受压力的影响,其传染性损失多于4 log。在高压、低温和低浓度尿素(1-2 M)的条件下,能观察到polio和rhino病毒的分裂。压力和低温数据清楚地表明稳定性的不同,在三种小核糖核酸病毒FMDV是最敏感的,polio最有抵抗力,rhino有中间体的稳定性。
    图6表达了小核糖核酸病毒由压力和低温引起的变化。最重要的特征是压力循环后有与传染性粒子(称为P粒子)的结交。更激烈的变性处理,例如用高浓缩尿素,导致不可逆伸展。这一方案还出现可能丧失传染性的解释,如前面其他作者提出的小核糖核酸病毒的热处理[79],有缺陷的粒子将损失VP4和/或跃入canyon的小分子(据为己有的因子)。压力灭活小核糖核酸病毒类似于在与宿主细胞相互作用的脊髓灰质炎病毒和鼻病毒中检测到的A-粒子,它还缺少内在的衣壳蛋白VP4 [78,79]。A-粒子比原有的病毒更充分地丧失了传染性,并考虑一个无衣壳中间体。该状态类似于‘熔合中间体’它在包裹病毒中被发现[80-82]。熔化过程中,衣壳蛋白结构和包膜醣蛋白的变化,一方面易导致传染的粒子,另一方面可以导致以前不可思议的抗原决定基的暴露,这对疫苗的发展是重要的。这是经过高压的结构的变化是不可避免,它类似我们已经讨论过的,在vivo中研究的大部分病毒发生的变化。 
    我们还用高压评估野生(wt)羊群覆盖病毒(FHV)的化脓分裂,和分裂有缺陷的突变异种(D75N) FHV类病毒粒子(VLPs) [83]。我们发现化脓分裂促成了亚稳状态,衣壳蛋白的分裂与伸展有关。我们的结果证明,因为化脓与伸展相关,化脓的过程将‘偏离路径’分解的粒子做为目标。化脓事实对粒子的传染性是非常重要的。
Fig. 7. 野生型压力的敏感性和分裂有缺陷的FHV VLPs
    羊群覆盖病毒(FHV)的压力稳定性:用内在荧光光谱的变换(光谱的质量中心,A),粒子平均尺寸分析(光散射,B),分析了野生型(圆形)和D75N(三角形)突变异种类病毒粒子。为了更好地鉴别压力的影响,通过增加1M亚分裂浓缩尿素使反应平衡。用尺寸排除的高精度流体层析法,对野生型FHV (C)和解压后的突变异种(D)的重新组装进行评估。
    成熟的粒子比分裂的有缺陷的粒子对压力更不稳定(图7),这可以通过亚稳度导致化脓来加以解释。我们还有一个证据,Q亚元在压缩和释压的循环后被释放。图6显示,由于picorperature在小核糖核酸病毒,有类似的情况发生。
    最重要的特征是在压力循环后有一个传染性粒子(称作P粒子)的再缔合。更强烈的变性处理,例如用高浓缩尿素,导致不可逆伸展。更强烈的变性处理,例如高浓缩尿素,导致不可逆变性。该方案对丧失传染性还出现一个可能的解释,还有与其他作者先前提到的一些小核糖核酸病毒的热处理[79],有缺陷的粒子将损失VP4和/或小分子(据为己有的因子)跃入canyon。
    用小核糖核酸病毒,用压力诱导释放VP4发生类似的情况(图7)。在两种情况下,压力诱导两种粒子的形成,出现无包膜病毒熔和活性状态。图7还显示野生型和突变异种衣壳完全可逆的反应。
    6. 用高压诱导病毒熔和的活性状态做为制作疫苗的方法
    为了向宿主细胞质传递它们基因组,包膜动物病毒经历膜的熔合[80^82]。我们最近发现在‘熔合中间状态’,通过诱捕粒子,高压灭活流行性感冒和Sindbis包膜病毒[85]。总之,我们显示等静水压在中性的pH下,促使流行性感冒和Sindbis病毒的醣蛋白结构的变化,它类似于在内涵体中通过被低pH触发的变化。我们的结果指出,压力营救亚稳的结构,通过粒子数量增加转换活性状态,尽管高能出现较小的体积(图8),自然状态(大体积)进入fusogenic状态(小体积)。压力用于粒子数量的增加熔合活性状态,能被新的抗病毒疫苗和药物应用。
    压缩和卸压后传染性粒子的形成在很多病毒中证明,如轮状病毒[86]、传染性囊病毒(IBDV) [14]、疱疹性口炎病毒(VSV) [10]、猿免疫缺陷病毒[11]、HIV[87]、流行性感冒[85]、lambda相[88]、小核糖核酸病毒[12]和alpha病毒[85,89]。对IBDV,高压引起传染性的消除,保留了免疫原性,并能提高病毒压制抗体的滴度[14]。VSV是包膜病毒,在2.5kbar的压力下,用足够的时间即可丧失传染性[10]。被压缩样品的电子显微镜显示并没有发现可观察到的分裂,但是亚元显示出在压力下从正常的位置上转移,在病毒包膜下面的突起附近可以看出。包膜病毒,包膜醣蛋白在压力下发生类似受体构象变化的结构的变化[85]。流行性感冒和HIV的包膜醣蛋白受到pH和受体活性结构的变化,表明它们的原始状态是亚稳的。对于流行性感冒病毒的变化通常涉及到‘受弹簧力作用’的模型。在熔合缩氨酸区域,被考虑在熔合的最初阶段插入目标包膜[80^82]。流行性感冒,低pH引起受弹簧力作用’的机制。
    我们发现经过色氨酸荧光和粘合bis-8-苯氨-1-奈磺酸盐(bis-ANS) ,流感病毒受到压力会暴露疏水区域,并在流感病毒上有fusogenic状态的很稳定的标记[85]。在自然pH状态下通过荧光能量共振转移用荧光探测器和脂囊标志,压力还导致熔合活性的增加[85]。这些数据表明包膜联合体的不稳定的自然状态的变化,模拟熔合活性结构,趋向更稳定。
    7.压力灭活病毒和其它微生物
    用两个潜在的应用的观点对静水压灭活病毒进行评价:疫苗的发展和病毒的杀灭[10^14,85^89]。考虑病毒疫苗,有三个基本的免疫策略:用活的(减毒)的粒子、杀灭(灭活)的整体病毒粒子、亚元疫苗(肝炎B)。免疫是预防动物和人类的传染疾病的最有效的方法[90]。抗体对抗受压病毒粒子像对抗完整病毒一样有效,通过在噬菌区缩小化验中中和滴定测得[10,12,14,86]。压力促使灭活轮状病毒[86],最重要的病毒介质引起发展中国家的导致百万儿童致命的痢疾的肠胃炎。受压的粒子的新结构没有导致免疫原性的损失。
    压力通过控制变化改变受体粘合蛋白质VP4,类似病毒与目标细胞相结合的产物[86]。因为压力造成VP4的结构的变化,导致病毒暴露给目标细胞,它导致有传染性的粒子 ,并可以暴露预先隐蔽的抗原决定部位,这对发展疫苗是非常重要的。
    最近,高压还用来灭活细菌螺旋体[91],它导致重要的动物和人类疾病的中间体。螺旋体interrogans serovar hardjo受到不同的静水压。电镜显示外膜的混乱,从受压螺旋体的细胞质的圆柱体中,出现螺旋形状的和轴向细丝突出的部分损失。压力处理接种在兔中的螺旋体时,它们有高免疫原性,现在评价明确表达疫苗。
    由压力灭活病毒引起的压制抗体的高滴度表明静水压能用来准备整病毒免疫原。有效的抵抗病毒的免疫原性需要整体病毒粒子对免疫系统的表达。利用高压准备抗病毒疫苗有超过其它方法重大的优势,例如减毒、化学灭活或单亚元疫苗。消弱活病毒在一定的时间后能恢复,并且能引起疾病,它被有意识地预防或恶化实际的疾病。
    单独亚元的免疫有几个问题,特别是因为免疫系统识别单独抗原的有效性低于整病毒。像高压这样的物理方法,准备杀灭的疫苗,就不会有同样的问题。
    为什么受压的病毒保留了免疫能力,其原因大概基于结构变化很微妙这样一个事实。我们讨论上述压力处理似乎仿效病毒进入细胞受体引起的变化。我们发现压力灭活的VSV进入细胞膜,但是没有通过细胞内吞作用内化。最合理的解释是高压导致包膜蛋白变成熔合结构[92]。
这类似通过转换状态相似物抑制酶,不同的是这里是物理手段、压力、在结构上冻结病毒蛋白,不能结合受体预防内吞作用的进行。因此,传染周期的其它步骤被损害。无论如何,灭活病毒的配属,例如VSV,向宿主细胞[92],用非生产的方法可以至关重要地引起免疫应答。首先,因为新抗原决定部位可以被暴露,它导致压制抗体的有效生产;第二,因为粒子虽然不传染,能用细胞加工,导致在细胞内响应(CD8. cytotoxic T lymphocytes; CTLs)。
    图6中表示的小核糖核酸病毒能延伸到包膜病毒,所不同的是压力释放在膜蛋白上引起主要变化。黑色圆圈表现出抗原决定部位,似乎出现在压力诱使熔合活性状态。
    对HIV疫苗应用熔合混合物的发展潜力进行了评估[93]。利用这一概念,具有较高级的免疫原性的抗原决定部位可以暴露或创造,HIV-1与细胞膜熔合,他们尝试熔合混合物,为了证实他们在老鼠上诱导中和抗体的能力。熔合有效的HIV疫苗的免疫原性是通过甲醛与病毒-细胞联合体连接而形成的。固定病毒和整体细胞的准备得到抗体的能力,抑制并分离主要HIV 24的23的传染性。作者提出依赖与免疫原熔合,可以导致广泛有效的HIV疫苗。 
    可是,这种方法的主要问题是病毒和细胞的混合物的准备含糊不清。由于高压能够产生相同的熔合中间状态,至少在一些病毒的研究中,它是一种清楚的更可以操作的生产抗病毒疫苗的方法。
    8.结论和前景
    方法的越来越多的应用,例如NMR,去描绘压力变性的状态,在‘蛋白质折叠问题’上解决完整事务中缺少一个环节,用压力是更有前途的技术之一。压力还可以表现蛋白质高度的可塑性。最近关于压力伸展和折叠动力学的详细的研究与几个理论一起接近,增加了我们对压力作用的理解[94,95]。此外,通过最近用压力处理,折叠中间体的分离对理解蛋白质错误折叠和聚合是相当重要的。Amyloidogenic中间体的总和没有进入聚合是压力的唯一特征,它开辟了表现amyloidogenic形成结构的前景。几种压力的联合接近详细剖析包装和空穴在折叠和在多分子结构装配的作用,例如蛋白质-DNA联合体和病毒。
    在分子水平上,蛋白质、蛋白质-DNA联合体和病毒的压力/冷变性表明它们的过程伴随着暴露非极性侧链实际比例的溶剂。与期待相反,大部分反应导致蛋白质折叠,DNA的识别和病毒的装配是熵的驱动,这意味着受弱反应(非极性)和极性的很少的影响,或H键的反应,正常的期待是通过在ΔH的变化被驱动。
    我们的模型支持这样一个观点,DNA识别和病毒装配包括大的构象变化,主要地表现为通过减少非极性侧链与在‘疏水键’中水的增加的接触。Weber[96]发表了第一流的理论,它归结于蛋白质的熵-驱动特性,大量的弱蛋白键胜于溶剂-溶剂的反应。Weber的提议重视蛋白质结构的分配,该结构是由高分子结构的动力学本性产生的。
    疏水键的经典理论和Weber理论能公正地解释蛋白质、蛋白质-DNA和病毒的冷变性[97]。在这两个理论中,最终导致熵驱动联合体的生产的结果是溶剂的置换和无极反应(London 分散力)的形成。但是,Weber理论布置了更积极的弱反应的增加生产熵的合作,指出对这些反应的高等级特异性。
    在高压和低温下病毒粒子的稳定性降低提出医学重大价值的灭活病毒的有潜力的应用。我们发现有几种病毒是通过压力和室温条件下灭活的。实在的证据证明高压在‘熔合中间状态’诱捕病毒(与alpha病毒、流行性感冒、逆转录酶病毒等熔合),没有传染性,但是有很高的免疫原性,对发展疫苗非常有前途。

    压力导致的熔合活性状态的种群能被利用在新的抗病毒疫苗和药物。病毒在室温下抵抗压力的稳定性,在温度降低时的施加压力会降低。这些研究不但对生产抗病毒疫苗有潜力,而且净化生物制品,例如血液、血浆及其制品是有重要性的。

相关标签:食用菌灭菌设备,
相关新闻RELATED NEWS
相关产品RELATED PRODUCT
售前电话:13332066993
地址:天津西青区津静公路海泰发展一道3号
大时代彩票官网www.djoscure.com版权所有© www.djoscure.com(复制链接) 天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司

超高压提取、食用菌灭菌设备、超高压实验设备、超高压提取设备、超高压食品加工设备、天津食用菌灭菌设备、超高压冷灭菌设备、超高压食品提取设备,欢迎来电!

热门城市推广:

Powered by 筑巢
友情链接:大时代彩票官网  人人彩票  人人彩票  人人彩票官网  大时代彩票  多赢彩票  多赢彩票  

免责声明: 本站资料及图片来源互联网文章,本网不承担任何由内容信息所引起的争议和法律责任。所有作品版权归原创作者所有,与本站立场无关,如用户分享不慎侵犯了您的权益,请联系我们告知,我们将做删除处理!